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Olomoucine与decorin联合抑制大鼠脊髓损伤后的星形胶质细胞增殖和瘢痕形成

发布时间:2014-10-20 09:46   浏览量:  次

  摘要 本课题通过采用药物olomoucine和decorin联合抑制T10横断大鼠星形胶质细胞增殖和瘢痕组织形成,为损伤脊髓轴突的有效再生创造一个良好的生长微环境,从而能够促进脊髓损伤节段以下运动和感觉功能的恢复。实验分为olomoucine治疗组、decorin治疗组、olomoucine与decorin联合治疗组以及空白对照组4组。各组在治疗后第4天、7天及28天各处死动物各6只,分别对大鼠进行行为学检查(BBB功能评分)和荧光免疫组化检测(双重或三重荧光免疫细胞化学法)。观察大鼠脊髓损伤节段以下运动功能的恢复程度,大鼠感觉和运动神经的恢复程度,运动皮质脊髓束的再生(用BDA顺行标记)、上行背侧感觉性轴突的再生(用BDA顺行标记)和AS增殖的表达程度(GFAP标记),以及再生神经纤维的密度。分析并阐述其作用机理,为今后的实验和临床应用提供动物实验依据。

  关键词 脊髓损伤;星形胶质细胞;联合抑制;BBB功能评分;荧光免疫组化

  1. 国内外研究概况

  脊髓损伤后,影响脊髓神经轴突再生的主要阻碍因素是胶质瘢痕,有效抑制星形胶质细胞(astrocytes,AS)的过度增殖和阻止瘢痕组织形成方面是我们研究的重点。目前针对抑制AS过度增殖和瘢痕组织形成的实验研究集中在抑制活化型AS的增殖、阻止AS的激活、调控AS核转录因子NF-kappaB、限制性AS前体细胞移植和基因修饰AS等方面。

  (1)针对CDK抑制剂 olomoucine的研究

  细胞周期素依赖的蛋白激酶(cyclin-dependent protein kinases,CDK)Olomoucine干预可以明显下调脊髓损伤组织中细胞周期素 cyclin A、cyclin B1、cyclin E和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)PCNA的高表达,从而有效抑制AS细胞的增殖[1]。Olomoucine作用机制为竞争ATP结合位点来抑制蛋白激酶活性,导致了CDK1、CDK2 及 CDK5等酶活性的降低[2],从而抑制了cyclin E-CDK2 、cyclinB-CDK1 、cyclin A-CDK2、brain CDK5-p35 复合物和 ERK1/ MAP激酶的活性[3]。这些被抑制的复合物、激酶能与其底物发生作用,推动细胞周期继续前进、启动DNA复制和有丝分裂。研究表明,成年小鼠中枢神经系统损伤后,通过中枢给药法予以olomoucine干预后,可明显减少细胞周期蛋白的增量调节,抑制AS、小胶质细胞的增殖,减轻胞体肥大[4]。但是,Olomoucie对细胞凋亡的影响是复杂的,与细胞的类型、抑制的CDK类型等有关。olomoucine只能选择性地抑制cdk1、cdk2、cdk5和erk1,而对cdk6的抑制作用较弱,对cdk4则无抑制作用[5]。GAP-43是神经元轴突生长发育和可塑性的分子标记物,正常的成熟 CNS中 GAP-43较微弱[6]。研究发现,SCI后GAP-43的表达上调,表明其可能参与了损伤后神经生长修复的过程;在给予olomoucine治疗后GAP-43表达增高,较损伤对照组更为明显,且4周后仍维持在较高水平[1]。

  (2)针对核心蛋白多糖decorin的研究

  Decorin 能与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ型胶原相互作用,但与Ⅰ型胶原关系最为密切[7]。Decorin能结合或“修饰”Ⅰ型胶原原纤维,调节胶原原纤维的重组和生长。Decorin缺乏时,Ⅰ型胶原纤维异常(韧性差、易脆),且生成减少。Decorin抑制病理性瘢痕的最主要机制之一是其抑制了转化生长因子-β(transforming growth factor,TGF-β)的作用,同时下调细胞Ⅰ、Ⅲ前胶原的 mRNA 表达,有效地抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖。Decorin能中和并灭活TGF-β, 目前多认为 decorin可通过旁分泌和自分泌的方式在细胞外基质(extracellular matrix,ECM)部位结合TGF-β1而起到中和TGF-β1的作用,是自然条件下产生的TGF-β所致纤维化反应的抑制剂。Decorin有两个所有TGF-β同工型的结合位点,能与TGF-β1 、β2 、β3 结合,使其活性降低,它是TGF-β最重要的负调节剂,能抑制培养细胞TGF-β的生物活性。利用特殊抗体(6-B-6,LF-96)免疫标记浸渍法,也发现Decorin的核心蛋白能够抑制胶原纤维的生长,中和TGF-β,从而抑制纤维化[8]。神经系统内的decorin能够调节细胞外胶原基质,促进轴突纤维结合蛋白粘附、施万细胞(schwann cells, SCs)增殖和(或)不同神经细胞的存活[9]。实验表明,把人类重组核心蛋白多糖(human recombinant decorin,hr-decorin)快速注入被戳伤的大鼠脊髓背侧柱传导通路内,可以有效抑制炎症反应、AS纤维化增生、多种轴突生长抑制因子(chondroitin sulfate proteoglycan CSPG),从而可以促进轴突生长穿过损伤界面。Decorin可以高效(90%)抑制CSPG,说明它不仅可以抑制CSPG的合成,还可以促进CSPG的降解。因为丝氨酸蛋白酶能够降解CSPG及其酶原,所以在研究decorin治疗大鼠急性SCI的实验中发现decorin能够增加纤维蛋白溶酶原(plasminogen)/纤维蛋白溶酶(plasmin)的合成。在SCI损伤后注射hr-decorin第8天,可以分别使损伤界面内plasminogen 和 plasmin的蛋白水平升高10和17倍;在体外实验hr-decorin可以使小神经胶质细胞的plasminogen mRNA升高3倍。Plasmin除了能够降解胶质瘢痕内多种轴突生长抑制的成分之外,还能够激活神经营养因子和促进中枢神经系统(central nervous system,CNS)的重建[10]。

  2. 存在的问题

  (1)目前,国内外学者针对抑制AS增殖和胶质瘢痕形成的实验研究花费了不少的心血,但是还未找到有效的确实可行的治疗方法。

  (2)为了有效抑制AS增殖和胶质瘢痕形成,我们以往的实验一般都是采用某一种方法干扰某一个环节,很难有效控制AS增殖。

  (3)脊髓损伤后AS被激活,从静止态向活化态转化,直至增殖态,而且AS的这三种状态往往并存,形成原因复杂,我们单独运用一种方法难以达到预想的效果。

  3. 本课题的主攻关键

  (1)分析和比较olomoucine与decorin在抑制脊髓损伤后AS的增殖和胶质瘢痕形成时的不同作用效果和作用机制。

  (2)联合运用olomoucine与decorin抑制脊髓损伤后AS的增殖和胶质瘢痕形成的作用效果及其作用机制。

  4. 创新之处

  (1)整体考虑AS的三种状态,在脊髓损伤的早期,采用联合抑制的方法,有效抑制活化的AS,避免AS达到增殖态。

  (2)联合抑制可以针对AS增殖的主要因素,重点干扰AS周期的G1 /S和 G2 /M转折点,兼顾消除已形成胶质瘢痕。

  (3)采取中枢给药和腹腔注射相结合的方式,保证了治疗时间内需要的有效药物浓度。

  (4)中枢给药采取7点注射的方式,保证了有效抑制AS的作用范围。

  2 材料与方法

  (1)组别设计

  选用体重200±10g,健康雄性SD大鼠120只,造模后按照处理的因素不同随机分为olomoucine治疗组、decorin治疗组、olomoucine与decorin联合治疗组以及空白对照组4组,每组30只;每组按照治疗后检测时间的不同又分为1天、7天、14天、21天及28天5个观察组,每个观察组各6只。

  (2)SCI动物模型制备

  T10完全横断伤模型:大鼠俯卧位固定,1%戊巴比妥钠30mg/ kg腹腔内注射麻醉后,背部剪毛、脱毛、消毒,无菌条件下以T10 棘突为中心,在T8–T12水平切开皮肤,长约3cm ,紧贴棘突骨面纵形分离椎旁肌,直达椎板表面,用小乳突牵开器向两侧牵开椎旁肌,显露出T9-T11的椎板和棘突。然后将大鼠固定于手术架上,咬骨钳咬除T9 -T11的棘突,在手术显微镜下用高速牙科钻沿上下椎间关节内侧纵向磨开T9-T11的椎板,用显微镊小心移除椎板,避免撕破血管。在显露的脊髓的中间位置纵向剪开硬脊膜和蛛网膜,将刮胡刀片掰成极窄的锐角三角形状,用其锐利的尖端在显露出的脊髓背静脉和两侧脊髓背动脉之间分别横向切开软膜和脊髓实质,并于软膜下,切除脊髓2 mm,保留脊髓背静脉、两侧的脊髓背动脉和脊髓腹动脉。镜下观察确保完全离断,脊髓缺损处无组织残留,切口处以外的软膜要保持完整。切断脊髓后随机分组,组别处理后用11/0显微缝合线缝合硬脊膜,置入20,000U青霉素后缝合肌肉、皮肤。模型制备及治疗完成后放回鼠笼,连续3天注射青霉素(50,000U/kg/d),每天大鼠人工排尿至少两次以上,直到膀胱排空反射建立后为止。

  (3)组别处理

  实验注射位置的选择有三个部位(损伤中心、头尾侧2mm横截面),共7个注射点(损伤中心、距损伤中心头尾侧2mm横截面的左右及正中部);头尾侧横截面正中部注射点分3个层次:前层深1.5mm、中间层深1mm、后层深0.5mm;头尾侧横截面左右仅为一个层次,深度与正中部的中间层深度保持一致。每只大鼠用量:损伤中心注入5ul,离损伤中心头尾侧2mm处的横截面内(每个横截面5个点分别给药0.5 μl)各注入2.5 μl,共10 μl。

  ① Olomoucine治疗组:脊髓横断后即刻把olomoucine(美国Sigma公司)注入7个注射点;用量4 mg/kg,先用二甲基亚砜(DMSO)溶解,后用蒸馏水稀释至olomoucine终浓度为0.08mg/μl。24小时以后,定期腹腔注射olomoucine(4mg/kg)。

  ② Decorin治疗组:脊髓横断后即刻把decorin(美国Sigma公司)注入7个注射点;每只用量为125μg/kg,先用二甲基亚砜(DMSO)溶解,后用蒸馏水稀释至decorin终浓度为2.5μg/μL。24小时以后,定期腹腔注射decorin(25μg/次)。

  ③ Olomoucine与decorin治疗组:Olomoucine治疗组+ Decorin治疗组处理方案。

  ④ 空白对照组:脊髓横断后即刻把等量的二甲基亚砜稀释溶液注入7个注射点。24小时以后,定期腹腔注射等量的二甲基亚砜稀释溶液。

  (4)行为学检查及神经电生理检测

  各组分别于治疗后第1天、7天、14天、21天及28天观察记录大鼠后肢活动及行走情况,对大鼠后肢功能进行BBB功能评分;同时进行神经电生理检测。

  行为学观察采用BBB运动功能评分(the Basso,Beattic and Bresnahan locomotor rating scale,BBB)方法,将大鼠后肢运动分为22个等级:后肢全瘫为0分,完全正常为 21分,两者之间根据运动功能恢复的不同程度分别确定为1-20分;其基本内容为关节活动的数目和范围;负重程度及前后肢协调性;前、后爪和尾部的活动情况。BBB运动功能评分观察时间为4min,动物应尽量保持在活动范围的中心区域活动。神经电生理检测包括皮层体感诱发电位(cortical somatosensory evoked potential,CSEP)和皮层运动诱发电位(cortical motor evoked potential,CMEP)两部分,分别检查大鼠感觉和运动功能的恢复程度。

  (5)荧光免疫组化(双重或三重荧光免疫细胞化学法)

  各组分别于治疗后第1天、7天、14天、21天及28天处死动物各6只,进行双重或三重荧光免疫细胞化学法检测,经荧光图象分析系统观察和分析轴突再生及GFAP等的表达程度。

  在动物处死前两周用生物素葡聚糖胺(BDA)顺行标记皮质脊髓束,只适用于两周或以上的观察组;在动物处死前3天用霍乱毒素B亚单位(choleratoxin B)进行透神经胶质法标记上行背侧感觉性轴突,只适用于3天或以上的观察组;GFAP标记AS;神经纤维(nerve fiber,NF) 标记轴突密度。用4%多聚甲醛心脏灌注后,完整取下大鼠的脊髓;冰冻切片及经HE染色后,在荧光显微镜下观察脊髓横断近端与远端各标记物的荧光表达,利用成像软件对各标记物定量分析。

  (6)统计学处理

  采用SPSS统计软件处理。根据资料性质选择适当的统计分析方法。

  2.意义

  脊髓损伤后星形胶质细胞增殖和瘢痕组织形成,是脊髓轴突再生和生长的抑制性微环境的主要因素,本课题通过联合运用药物olomoucine和decorin来抑制星形胶质细胞增殖和瘢痕组织形成,为损伤脊髓轴突的有效再生创造一个良好的生长微环境,从而能够促进脊髓损伤节段以下运动和感觉功能的恢复。本课题采用联合抑制AS的方法是突破SCI治疗研究瓶颈的关键,这种思维模式正是符合医学发展的需要,为我们今后的实验和临床提供一种新的思路。该课题紧紧围绕临床问题来设计实验方案,如果研究成功,将是我们迈入一系列SCI基础和临床研究的第一步,也会为以后的临床治疗带来希望;不仅会为广大近乎绝望的脊髓病人带来康复的曙光,而且会大大减轻社会的人力和医疗负担,挽救无数个家庭。

  参考文献:

  [1] 田代实,王伟,等.细胞周期素依赖性激酶抑制剂 olomoucine对大鼠脊髓损伤后轴突再生微环境的影响及其意义. 中华医学杂志,2006,86(13):901-905.

  [2] King KL,Cidlowski J A.Cell cycle regulation and apoptosis. Annu Rev Physiol,1998,60: 60.

  [3] Abraham R T,Acquarone M,Andersen A,et al1. Cellular effects of olomoucine, an inhibitor of cyclin2dependent kinases[J]. Biol Cell,1995,83: 105.

  [4] Cernak J,Stoica B,Byrnes KR,et al. Role of the cellcycle in the pathobiology of central nervous system trauma[J]. Cell Cycle,2005,4(9):1286-1293.

  [5]Krystof V,McNae IW,Walkinshaw MD,et al. Antiproliferactivity of olomoucineⅡ,a noval 2,6,9-trisubstituted purine cyclin-dependent Kinase inhibitor[J]. Cell Mol Life Sc,2005,62(15):1763-1771.

  [6] Cafferty WB,Gardiner NJ,Das P,et al. Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice[J]. J Neurosci,2004,24: 4432-4443.

  [7] Batbayar T,NomuraY,IshiiY,et al.Affinity of placental decorin for collagen [J]. Biosci Biotechnol Biochem,2000,64(11):2478-2481.

  [8] Fukui N,FukudaA,KojimaK,et al.Suppression of fibrous adhesion by proteoglycan decorin [J]. J Orthop Res,2001,19(3):456-462.

  [9] Hanemann CO,Kuhn G,Lie A,et al. Expression of decorin mRNA in the nervous system of rat[J]. J Histochem Cytochem,1993,41(9):1383-1391.

  [10]Jeannette E. Davies,Xiufeng Tang,Juan C. Bournat,Stephen J.A. Davies. Decorin Promotes Plasminogen/Plasmin Expression within Acute Spinal Cord Injuries and by Adult Microglia In Vitro.J Neurotrauma,2006,23(3-4): 397-408.

作者:管理员  来源:未知
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